基于固态纳米孔的单分子测序能够极大扩展纳米孔技术在DNA、蛋白质和糖领域的应用潜力。虽然制备超薄二维（2D）材料的固态纳米孔在测序方面具有分辨率高的潜在优势，但是至今未能实现单分子DNA测序，最大的困难在于传统的固态纳米孔通常使用电子束或离子束制备，导致纳米孔结构不能达到高度均一，因此重复性差。二维共价有机框架材料（2D COF）是一类共价键链接的晶态聚合物，具有原子级可控的纳米孔阵列结构，为固态纳米孔实现DNA测序创造了条件。
近日，化学化工学院王康课题组、袭锴课题组与生命科学学院吉丽娜课题组合作开发了一种以石英纳米管为支撑的COF纳米孔器件（COF孔径约为1.1 nm），用于单分子DNA传感。此COF纳米孔不仅能实现四种核苷酸（dNMP）的粗略分辨，并且对150个核苷酸DNA模型分子（dA50dC50dA50和 dC50dA50dC50）的部分电流阻塞显示出明显的DNA序列特异性凹凸电流阻塞模式，这为固态纳米孔实现单分子DNA测序迈出了重要一步。
首先，以石英纳米管作为基底，将超声剥离的2D COF 纳米片通过电泳分别覆盖在小口径（7±3 nm）和大口径（20±5 nm）的石英纳米管尖端，得到基底口径大小不同的两种COF纳米孔器件（图1）。记录的I-t曲线中，单次电流降表明仅有一片COF纳米片覆盖在石英纳米管尖端。同时，I-V曲线表明小口径石英管作基底的COF纳米孔的电流始终小于大口径石英管作基底的COF纳米孔，证明基底口径的减小可以降低背景电流，这有利于后续的单分子检测。
图1. COF纳米孔器件的制备与表征
利用基底口径大小不同的COF纳米孔器件分别对dAMP和dCMP进行单分子分析（图2），发现只有小口径石英纳米管作为基底时可实现dAMP和dCMP的粗略分辨，表明减小作为基底的石英纳米管的口径能明显提高COF纳米孔的检测灵敏度。同时，使用其它的小口径石英纳米管作为基底的COF纳米孔器件也能实现四种核苷酸的分辨。
图2. COF纳米孔分辨dAMP和dCMP
随后，利用小口径的石英纳米管作基底制备的COF纳米孔对两类具有特异性序列的DNA模型分子（dA50dC50dA50和 dC50dA50dC50）进行单分子分析（图3），部分电流阻塞显示出明显的DNA序列特异性的凹凸电流阻塞模式，展示了2D 框架材料纳米孔用于单分子DNA测序的潜力。
图3. COF纳米孔识别序列特异性DNA
为了探究单分子DNA的易位行为，作者细致研究和分析了dA50dC50dA50和 dC50dA50dC50穿过COF纳米孔的电流阻塞信号，其模式可分为TypeⅠ、TypeⅡ和TypeⅢ三类，主要取决于DNA穿过纳米孔时与石英纳米管壁的相对位置（图4）。在实验条件下，石英纳米管带负电，阳离子是主要载流子，双电层（EDL）内的K+浓度远高于沿中轴线的K+浓度。因此，当DNA穿过EDL层内的COF纳米孔时，由于静电排斥会产生较大的电流降和较为明显的凹凸电流阻塞模式。同时，有限元模拟结果也证实了具有明显凹凸电流阻塞模式的出现很大程度上取决于DNA链的运输位置。
图4. 探究单分子DNA的易位行为
本工作证明了二维多孔框架材料纳米孔在单分子测序领域的应用前景，为固态纳米孔实现DNA测序提供了一定的参考和借鉴。
这一成果发表在ACS Nano（2024，doi: org/10.1021/acsnano.4c09848）上，南京大学化学化工学院王康教授，袭锴教授以及生命科学学院吉丽娜副教授为该论文的共同通讯，博士研究生郭林茹为该论文第一作者。本工作得到了国家自然科学基金22327802、22174060和生命分析化学国家重点实验室5431ZZXM1907的大力支持！