肿瘤新抗原（neoantigen）通常源于肿瘤特异性的基因改变、转录或者翻译错误以及翻译后修饰，其来源肽段可经主要组织相容性复合体（MHC）分子呈递并被T细胞识别。凭借较高的肿瘤特异性及诱导抗肿瘤免疫应答的潜力，新抗原已成为个体化肿瘤疫苗和T细胞受体（TCR）相关免疫治疗的重要靶标。近年来，随着肿瘤基因组、转录组测序及计算预测技术的发展，研究者能够系统预测和筛选大量候选新抗原。然而，计算预测并不能直接证实候选肽段是否在肿瘤细胞表面天然呈递，而传统质谱检测的验证流程涉及多步样本处理，需要大量样本且操作繁琐、耗时费力。因此，如何从有限的复杂生物样本中，直接验证候选新抗原肽的天然呈递，并准确测定其呈递丰度，仍是新抗原筛选和精准肿瘤免疫治疗中的重要挑战。
纳米孔道技术基于单个分子通过纳米尺度孔道时产生的离子流变化，实现无标记、高通量的单分子分析，近年来在多肽分析与测序领域受到广泛关注。然而，已有研究大多建立在合成多肽的模型体系中。能否无需复杂的样品分离和纯化过程，直接从真实生物样本乃至临床样本中“找到”特定多肽，实现精准识别并进一步对其准确定量，是纳米孔道技术从单分子方法走向实际生物医学分析的关键一步。
针对这一挑战，南京大学从事纳米孔道单分子测量研究的李孟寅助理教授与从事肿瘤免疫研究的李劼教授合作，提出了数字纳米孔道计数（Digital Nanopore Counting）策略。通过设计多识别域纳米孔道，结合水渗流驱动的定向分子转运机制，同时提升每一个信号的信息维度和分子捕获效率；进一步结合多维信号特征提取与机器学习分类算法，将每一个纳米孔道信号转化为具有明确分子身份的“数字事件”，从而实现目标新抗原的直接识别和定量。
以卵清蛋白相关抗原（OVA）和Epstein-Barr病毒相关抗原肽（LMP1）为例，该方法从细胞表面洗脱的复杂免疫肽样本中直接识别并定量外源负载和内源表达的目标抗原，而无需对洗脱多肽进行复杂分离纯化；对于仅相差一个氨基酸的变体序列也能在复杂细胞样本中实现高分辨识别和准确定量。同时，构建的数字纳米孔道平台大幅降低了新抗原测量的样本需求，将传统质谱法通常所需的百万级细胞降低至5000个细胞以下，并将检测时间缩短至30分钟以内；结合微液滴纳米孔道体系，进一步实现了亚飞摩尔水平的定量。该研究表明，纳米孔道单分子测量正在从高度可控的多肽模型体系测序进一步走向复杂真实生物样本。未来，该方法有望作为基因组预测和免疫肽组学发现之后的直接实验验证工具，对候选新抗原进行快速确认与定量，为个体化肿瘤免疫治疗中的新抗原筛选提供新的技术路径。
相关成果以 “Digital Nanopore Counting Enabling Direct Identification of Trace-Level Neoantigens in Native Biological Samples” 为题发表于 Journal of the American Chemical Society。南京大学化学学院李孟寅助理教授、李劼教授与龙亿涛教授为共同通讯作者，博士研究生高妍、吴蕴泽为共同第一作者。此研究获得国家重点研发计划“非质谱依赖的体液蛋白质组检测新技术体系与应用研究”等资助。
图1：数字纳米孔道识别平台建立
图2：细胞样本中OVA抗原与Epstein-Barr病毒相关抗原的单分子直接识别与定量