蛋白质是生命活动的核心执行者，其序列信息是解码生物过程与疾病机制的关键钥匙。然而，Edman降解和质谱等传统测序技术在检测灵敏度与动态范围上存在明显局限，难以对低丰度蛋白以及翻译后修饰进行全面、精准的分析。这一技术瓶颈推动了单分子肽测序的发展，以期实现单分子水平上肽序列的直接、高分辨率解析。
纳米孔是一种新兴的单分子测序技术，已经在核酸测序领域取得突破性进展，也为蛋白质组学研究的技术革新提供了全新的解题思路。但是，纳米孔肽测序技术的开发面临着远超核酸测序的多重挑战，不仅需要精准区分构成肽链的20种天然氨基酸与种类繁多的翻译后修饰，还需要克服肽链折叠结构与非均匀电荷分布所带来的检测困难。这些挑战对纳米孔道的空间分辨能力提出了极高的要求，同时也亟需发展更有效的测序策略，以实现肽段序列的可控、顺序读取。
近日，我院黄硕教授团队在单分子肽测序领域取得了重要突破：报道了一种名为“动态孔物成环”（简称孔物成环）（transient Pore Analyte Looping，tPAL）的新型纳米孔检测模式，并结合首创的“边切边测”（chop and measure）策略成功实现了单氨基酸分辨率的肽序列测定。在该工作中，研究团队通过遗传密码子扩展技术构建了首个具有双重反应位点的工程化纳米孔（图1a），并对其进行了双重功能化修饰（图1b），建立了全新的tPAL检测模式。在这种独特的检测架构下，待测肽分子的C端被共价锚定在孔道下沿，其游离N端可以与孔道识别区修饰的次氮基三乙酸-镍离子（NTA-Ni）适配器形成可逆配位结合，从而实现对单个肽分子的连续、重复且高精度的测量（图1c，d）。
图1：tPAL测量体系的构建
在此基础之上，研究团队进一步引入了胆固醇修饰的氨肽酶，借助胆固醇基团与磷脂膜的相互作用，将氨肽酶富集在孔道周围，对孔道上锚定的单条肽链进行逐个氨基酸的顺序水解。在此过程中，NTA-Ni适配器可同步识别每一步酶切后肽链N端的变化，并输出对应的特征电流信号（图2a）。通过基于3-mer的解码策略结合机器学习模型对测序信号进行识别与解码，可以重构出完整的肽序列（图2b-e）。该方法解决了长期以来纳米孔肽测序分辨率不足、信号均一性差的关键瓶颈，实现了单氨基酸分辨率的序列读取，能够直接识别出肽链中的单个氨基酸突变、翻译后修饰及非天然氨基酸插入，为手性肽分析及蛋白质组学研究提供了全新的技术路径，展现出广阔的应用前景。
图2：基于“边切边测”策略的肽测序方法
该工作以“Sequential reading of a stepwise shortened peptide immobilized on nanopore”为题，于2026年7月29日在《Nature》发表（论文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-026-10881-1）。我院黄硕教授为该论文的唯一通讯作者，我院博士生陈佳璐、张含含及博士后王可凡为该论文的共同第一作者。此项研究得到了生命分析化学全国重点实验室以及南京大学化学和生物医药创新研究院（ChemBIC）的重要支持，科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、中央高校基本科研业务费资助项目、中国博士后科学基金会等经费支持。