近日，南京大学化学化工学院郑鹏教授与郭子建院士合作，利用单分子力谱技术和分子动力学模拟研究了HMGB1蛋白与顺铂-DNA结合的分子机制及其受蛋白磷酸化的调控。顺铂是一种广泛用于癌症治疗的经典金属药物，可以通过结合DNA造成损伤以达到杀伤癌细胞的效果。然而，细胞中的核酸剪切修复途径会修复顺铂造成的DNA损伤，从而抑制顺铂的功效。例如HMGB1蛋白可以特异性的结合顺铂损伤的DNA，结合后可以屏蔽修复途径。因此，深入理解和揭示HMGB1与顺铂化DNA的相互作用机制对研究铂类药物的抗癌效果具有重要的意义。
首先，作者通过点击化学和化学酶催化反应联用高强度和特异性的将顺铂化的DNA和HMGB1蛋白固定在力谱测量体系中，从而实现了DNA和蛋白质分子间结合强度的精准测量。单分子力谱实验结果显示，二者形成的复合物的解离力超过100 pN，是目前已知最强的天然DNA蛋白质复合物之一（图1）。同时拉伸分子动力学模拟揭示了第37位的苯丙氨酸是复合物解离过程中的关键位点。
图1. 通过点击化学和酶联反应联用固定顺铂-DNA和HMGB1 A domain，实现其结合强度的单分子力谱精准测量及其解离的分子动力学模拟研究。
之后，作者利用单分子力谱技术研究了DNA碱基序列（图2）和HMGB1全长蛋白的磷酸化修饰（图3）对二者相互作用强度的影响。根据测量得到的复合物解离力可以看到，相互作用强度主要受到顺铂结合的两个鸟嘌呤两侧的碱基种类影响。更进一步，作者根据之前的研究选取了HMGB1中三个丝氨酸位点进行磷酸化修饰，并用力谱对三种修饰后的蛋白与顺铂-DNA的结合强度进行了测量，同时在不同拉伸速度下测得了复合物的动力学参数。通过比较动力学参数koff，结果显示磷酸化后的HMGB1蛋白与顺铂-DNA的结合稳定性提高。在这些位点中，第14位丝氨酸的磷酸化对复合物稳定性影响最大，其koff值降低了约35倍。分子动力学模拟显示，磷酸化后的丝氨酸能与顺铂-DNA形成更多的氢键，从而提高了复合物的稳定性。
图2. 顺铂-DNA的碱基序列对复合物解离力的影响
综上所述，这项工作利用点击化学和酶法实现了对蛋白质和DNA的特异性固定，从而可以用单分子力谱精确测量蛋白-DNA相互作用。结果显示HMGB1与顺铂-DNA形成的复合物受碱基序列的影响, 也揭示了HMGB1的14位丝氨酸磷酸化通过形成更多的氢键，增强其与顺铂-DNA的复合物稳定性。
图3. 磷酸化修饰后的HMGB1与顺铂-DNA形成的复合物显示出更高的稳定性
相关研究成果近日以“Click Chemistry-Based Force Spectroscopy Revealed Enhanced Binding Dynamics of Phosphorylated HMGB1 to Cisplatin-DNA”为题发表于Journal of the American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc. 2024, 146, 19, 13126–13132)。我院19级直博生刘雨童、18级博士生宋东帆和20级本科生李森淼为本文的共同第一作者，郭子建院士和郑鹏教授为文章的通讯作者。此项研究得到了配位化学国家重点实验室、南京大学化学和生物医药创新研究院(ChemBIC)和南京大学高性能计算中心的大力支持，也得到了国家自然科学基金和江苏省自然科学基金等经费的支持。