糖类在生命活动中扮演着重要角色，其功能多样性源于复杂的结构特征。因此，精准识别寡糖结构对理解其生理和病理作用至关重要。然而，天然寡糖浓度低、异构化程度高，传统寡糖分析方法难以满足检测灵敏度和准确度要求，亟需开发新的检测方法。纳米孔道电化学技术具有单分子、无标记的优势，为糖类分析提供了新手段。但现有基于纳米孔道的分析方法对中性寡糖的检测浓度多在毫摩尔水平，尚不能达到天然寡糖异构体的区分需求。
南京大学龙亿涛/应佚伦团队长期专注于纳米孔道单分子电化学测量，建立了孔道立体结构与空间分辨能力的关系，通过增强孔道横向识别力场，实现了对系列多肽异构体分子的高灵敏识别与分析（J. Am. Chem. Soc. 2022, 144, 33, 15072-15078; Nat. Nanotechnol. 2024, 19, 1693-1701）。在此基础上，团队与中国科学院上海药物研究所合作，利用OmpF膜孔蛋白的天然电渗流特性及孔道内非对称限域结构，可达到对低浓度中性寡糖的高效识别，构建了一种超灵敏的寡糖异构体纳米孔道单分子电化学测量方法。
图1 基于OmpF纳米孔道的寡糖单分子电化学测量机制。
图2 低浓度天然寡糖的线性测量和实际样品检测。
通过系统性研究OmpF纳米孔道的离子选择性与立体结构特征，结合理论计算得到其电渗流速度是离子选择性Aerolysin突变体孔道的2.4倍，对中性寡糖具有普适性驱动力，将现有寡糖检出浓度降低了近两个数量级。结合多层感知器（MLP）机器学习算法，OmpF纳米孔道可精准识别仅含单个糖苷键差异的天然人乳寡糖异构体，对β3和β4糖苷键的区分准确率达99.9%。该方法进一步应用于细胞裂解液中的寡糖检测，可精准检出低至10 μM的寡糖浓度，并能对浓度比为1:100的异构体混合样品准确定量。这一分析方法上的突破为糖组学研究、疾病标志物发现和糖类药物开发提供了高灵敏度、宽动态范围的检测工具，有望推动纳米孔道糖测序技术的发展。
图3 机器学习辅助下寡糖异构体中单个糖苷键差异的识别。
图4 OmpF纳米孔道识别带有极性基团的寡糖异构体。
相关成果以“Identification of Oligosaccharide Isomers Using Electrostatically Asymmetric OmpF Nanopore”为题，发表于Angewandte ChemieInternational Edition，https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202422118。南京大学化学化工学院2021级直博生高凡为论文的第一作者；南京大学化学化工学院应佚伦教授、中科院上海药物所文留青研究员和夏冰清副研究员为论文的共同通讯作者。上海药物所高召兵研究员在寡糖异构体检测方面给予了指导和帮助。该研究获得国家自然科学基金面上项目及上海市糖专项等项目的资助。